一 .噬菌体展示技术介绍

     噬菌体是一种以细菌为宿主的病毒，由蛋白质外壳和其中包裹的DNA构成。大部分噬菌体长有“尾巴”，用来将遗传物质注入宿主体内。整个噬菌体的长度为20～200纳米。

     噬菌体是通过结合细菌表面的受体来感染特定的细菌，其生长周期分为3个阶段。 1）感染阶段: 噬菌体的尾部附着在细菌的细胞壁上，通过溶菌酶在细胞壁上打开一个缺口，将噬菌体DNA注入细菌体内；2）增殖阶段: 噬菌体DNA进入细菌后，在很短的时间内（通常几分钟），就会利用宿主细菌的“代谢机器”，大量地复制子代噬菌体的DNA和蛋白质，并形成完整的噬菌体颗粒；3）成熟阶段: 噬菌体有“烈性”和“温和”两种类型。在成熟阶段，烈性噬菌体会释放溶菌酶促使细胞裂解，从而释放出子代噬菌体；而温和噬菌体在侵入细菌后，其核酸附着并整合在宿主染色体上，和宿主核酸同步复制，子代噬菌体成熟后并不裂解宿主细菌。

噬菌体展示技术

     噬菌体展示技术由George P. Smith在1985年发明: 通过将外源基因插入丝状噬菌体f1的PⅢ基因，使外源基因编码的多肽与膜蛋白PⅢ形成融合蛋白，进而将外源多肽展示在噬菌体表面。之后在几组科学家，包括英国Laboratory of Molecular Biology的 Greg Winter和John McCafferty， 美国Scripps Research Institute 的Richard Lerner和 Carlos Barbas，以及德国 Cancer Research Center的FrankBreitling 和 Stefan Dübel的共同努力下，噬菌体展示蛋白库（包括抗体库）技术发展了起来，用于治疗性蛋白Medication的筛选。其原理是将外源基因文库插入噬菌体膜蛋白基因，然后将外源蛋白库（包括多肽库、小蛋白库和抗体库）展示在噬菌体表面。

     抗体是生物Medication的重要组成，这里我们详细介绍一下噬菌体展示抗体库。按照构建方法的不同，抗体库被分为3种不同的类型：天然抗体库（naïve antibody library），全合成抗体库（fully synthetic antibody library）和半合成抗体库(Semi-synthetic antibody library)。
     天然抗体库是指利用人或者动物外周血中的B细胞作为抗体库基因的来源，制备的抗体库。根据是否接受抗原免疫，进一步分为免疫库和非免疫库。人源的天然抗体库（也叫全人源库）是报道较多的能够成功制备单抗的抗体库，典型的是Cambridge Antibody Technology (CAT)的全人源库。CAT利用PCR方法从43个健康人的外周血B细胞中扩增出抗体重链和轻链（包括kappa和Lambda）的可变区基因（VH和VL），然后将Vh和Vl通过linker连接成单链抗体(scFv)并克隆至噬菌粒，感染大肠杆菌获得抗体库。由CAT全人源抗体库筛选得到的阿达木单抗（adalimumab ，Humira），被用于治疗自身免疫性疾病。该单抗Medication在2016年的全球销售额达到160亿美元。
     全合成抗体库是指用于构建抗体库的重链和轻链的可变区基因都来源于体外合成：首先选定代表性的抗体基因作为模板，然后利用分子生物学的技术在互补决定区（CDRs）引入高通量突变，从而形成多样性很高的抗体库。具代表的是Morphosys 公司的HuCAL（Human Combinatorial Antibody Library）和Genentech的抗体库。HuCAL在构建时选定了7个重链可变区框架（VH1A，VH1B， VH2，VH3，VH4，VH5，VH6）和7个轻链可变区框架（VK1，VK2，VK3， VK4， VL1， VL2， VL3），分别在其CDRs引入突变，然后将重链和轻链进行组合构建了49种不同的单链抗体库(scFv)。在2007年和2011年，Morphosys 分别公布了第二代HuCAL库（HuCAL GOLD）和第三代HuCAL库（HuCAL PLATINUM），通过在模板基因、展示技巧、抗体库多样性方面进行了优化，提高了抗体库的库容、筛选成功率、以及抗体在哺乳动物细胞上的表达。Genentech全合成库的设计思路与MorphoSys不同，Genentech仅采用了单一抗体基因为模板，通过在多个CDRs区域极限突变，形成库容量和多样性都非常高的抗体库。
     半合成抗体库是指在构建抗体库时，所使用的抗体基因有一部分是来源于合成的基因片段，而其它部分来源于天然的抗体基因。比较典型的两个半合成抗体库来自于BioInvent和Dyax。BioInvent抗体库利用固定的轻链和重链（分别为VL-DPL3和VH-DP47）为模板，在CDRs区引入天然的CDRs。 Dyax抗体库的轻链部分完全来自于天然抗体（正常人外周血B细胞）；重链选择了单一的重链基因VH3-23（DP47）为模板，在CDR H1和H2中引入设计的突变，在H3区引入了天然的抗体基因片段。

     在利用噬菌体展示抗体库技术获得的单抗Medication中，有7个成功上市，包括年销售额排名第1的Humira（阿达木单抗，修美乐），2016年全球销售额为160亿美元。 另外有57个利用噬菌体展示抗体库技术获得的单抗Medication处于临床1期到3期阶段。

表：噬菌体展示抗体库技术来源单抗的市场情况

二 全合成人源化纳米抗体库

纳米抗体（Nanobody）或者VHH抗体（Variable domain of heavy chain of heavy－chain antibody）是指仅由重链抗体可变区组成的基因工程抗体，应用广泛的是骆驼VHH抗体。骆驼抗体天然缺失轻链，保留了重链的VH和CH2、CH3区域，容易构建VHH抗体。相对于人、鼠VH，骆驼VHH具有严格的单域结构特性，展现出稳定性高（常温保存）、水溶性好和易于表达纯化等优点。骆驼VH CDR3区域氨基酸长度更长，容易形成凸环结构深入抗原内部，使得骆驼VHH的抗原亲和力并不逊于全长的人、鼠lgG抗体。骆驼和人VH有>80％的同源性，3D结构重合，骆驼VHH的免疫原性弱，人源化简单；同时骆驼VHH FR2的疏水残基被亲水残基取代，水溶性好，避免了由蛋白质聚集导致的免疫原性增强。另外VHH分子量小，适合用于多价／多功能抗体和ADCMedication的构建，也适合作为胞内抗体。但纳米抗体存在半衰期短的劣势，需要Fc融合、PEG化等技术延长半衰期。

骆驼免疫和纳米抗体制备

骆驼经过4次的抗原免疫后，采集外周血，分离淋巴细胞，通过PCR、基因克隆、噬菌体展示构建免疫库（“迷你”抗体库，库容10⁸）。再经过3-5轮体外筛选，挑选亲和力高的单克隆抗体并进行体外验证。

全合成人源化纳米抗体库技术

考虑到骆驼免疫、免疫库构建、抗体筛选和人源化改造的周期较长（6-12个月），动物免疫所需要的抗原量多（2mg左右），我们构建了全合成人源化VHH抗体库。其具有如下优点：1）抗体开发周期短，1-2个月可获得高亲和力纳米抗体；2）体外筛选，无需动物；3）抗原使用量少，常规开发只需要20ug抗原；4）通过外周血淋巴细胞PCR构建的天然库（免疫库和非免疫库）有效库容一般为10⁶-10⁸，而全合成库的库容量大，可达到10¹⁰，抗体筛选的成功率高；5）获得的是人源化纳米抗体，可以直接用于后续临床开发