1. 噬菌体展示系统
HTYC噬菌体展示系统是通过将外源基因文库插入到噬菌体预留的酶切位点,使外源基因编码的抗体、多肽或者蛋白与噬菌体M13的膜蛋白g3p形成融合蛋白,进而将突变文库在噬菌体表面展示出来。噬菌体展示系统是构建抗体库、多肽库、蛋白突变文库的基础工具。 我们提供的HTYC噬菌体展示系统包括:噬菌粒、Helper phage、感受态细胞和Su®Kunkel Mutagenesis Kit。
噬菌粒
Short phagemid: 含有全长的噬菌体衣壳蛋白g3p基因,外援片段插入后可与其融合表达,当与辅助噬菌体共感染含F'质粒的细菌时,可产生具有感染活性的重组噬菌体,外源蛋白可有效的暴露在g3p表面,便于小蛋白的下游筛选实验。适用于小片段的插入表达,如VHH、scFv和多肽突变文库。
Long phagemid: 含有截短的噬菌体衣壳蛋白g3p基因,外援片段插入后可与其融合表达,当与辅助噬菌体共感染含F'质粒的细菌时,可产生具有感染活性的重组噬菌体,外源蛋白通过g3p(截短)的呈递作用,可充分的展示在表面,便于进行针对外源蛋白的下游筛选实验。适用于长片段的插入表达,如Fab、scFab和蛋白突变文库。
Helper phage和Ex-helper phage
M13K07 Helper phage:含有M13噬菌体基因组,含有低拷贝复制子p15A ori,当与重组噬菌体共感染含F' 质粒的细菌时,可产生具有感染活性的重组噬菌体,融合g3p蛋白可有效的整合、表达于噬菌体表面。
电转用感受态细胞
HTYC提供多种与噬菌体展示相关的电转用感受态细胞,用于ssDNA制备、噬菌体展示和突变文库的筛选。
超级感受态细胞
HTYC提供超级感受态细胞的制备服务。我们制备的超级感受态SS320细胞和TG1细胞的电转效率高达≥4 × 1010 cfu/µg。
同时HTYC提供含有helper phage的超级感受态细胞的制备服务,如SS320(+helper phage)。
Kunkel 突变试剂盒(Su®Kunkel Mutagenesis Kit)
Kunkel Mutagenesis Kit基于Kunkel突变技术开发,适用于单位点和多位点的碱基添加、删除和突变。
2. 天然以及合成抗体库
以羊驼、骆驼、鲨鱼、人VHH为代表的纳米抗体技术发展迅速,HTYC构建了高质量的羊驼、骆驼、鲨鱼、人VHH天然库(Su®Llama VHH Library)和全合成人源化VHH抗体库(Su®Humanized VHH Library),帮助客户快速筛选针对目的蛋白的天然纳米抗体和人源化纳米抗体。
VHH天然库 Su®Llama VHH Library
制备步骤
1 采取未免疫的羊驼、鲨鱼等外周血液
2 分离淋巴细胞、提取总mRNA、反转录成CDNA
3 利用巢式PCR扩增VHH片段 ,使用Su®Assemble kit将目的VHH克隆到Su®short phagemid 载体中构建天然VHH DNA 文库
4 将DNA文库电转入超级感受态细胞SS320(含helper phage)中,构建天然VHH噬菌体库亚库
5 将多个亚库混合形成羊驼VHH天然库(Su®Llama VHH Library)
Su®Llama VHH Library特点
1 通过噬菌体展示系统构建
2 包含10个亚库( sub-libraries),总库容为1010
3 VHH-M13PIII融合蛋白单体展示
4 在VHH和M13 PIII之间插入琥珀密码子:在抑制性 (suppressor strains,如XL-1 Blue MRF’、TG1, DH5aF’、ER2738)中表达为VHH-M13PIII融合蛋白,展示在噬菌体表面;在非抑制性菌株(non-suppressor strains,如××××0F'、JS5菌株) 中表达为可溶性VHH蛋白,带c-Myc标签
5 建库使用超级感受态细胞SS320(含helper phage);筛选使用Su®DH5aF'+M13K07 Helper phage
全合成人源化VHH抗体库 Su®Humanized VHH Library
制备步骤
1 从天然VHH抗体库中分离出表达好、稳定性高的单克隆,进行人源化改造
2 挑选表达好、稳定性高的人源化单克隆VHH作为模板,克隆到Su®short phagemid 载体中
3 利用Su®Kunkel Mutagenesis Kits 对CDR区域进行高通量突变,构建突变VHH DNA文库
4 将DNA文库电转入超级感受态细胞SS320(含helper phage)中,构建突变VHH噬菌体库亚库
5 将多个亚库混合形成全合成人源化VHH抗体库(Su®Humanized VHH Library)
Su®Humanized VHH Library特点
1 通过噬菌体展示系统构建
2 固定CDR H1和H2区域,在CDR H3区域引入突变
3 CDR H3长度为10-20氨基酸
4 包含11个亚库( sub-libraries),总库容为1010
5 VHH-M13PIII融合蛋白单体展示
6 在VHH和M13 PIII之间插入琥珀密码子:在抑制性菌株 (suppressor strains,如XL-1 Blue MRF’、TG1, DH5aF’、ER2738菌株)中表达为VHH-M13PIII融合蛋白,展示在噬菌体表面;在非抑制性菌株(non-suppressor strains,如××××0F'、JS5菌株) 中表达为可溶性VHH蛋白,带c-Myc标签
7 建库使用超级感受态细胞SS320(含helper phage);筛选使用Su®DH5aF+M13K07 Helper phage
Su®Kunkel Mutagenesis Kit 优点
1. 可以多位点突变:适用于在多个CDR区域同时引入高通量突变,构建抗体突变文库
2. 突变效率高:单个位点突变效率可以达到80%以上,3个位点同时突变的效率可以达到50%以上
试剂盒组分
P-primer Mixture、Synthesis Mixture、10xTM Buffer、ddH2O
本试剂盒应保存于-20℃,保质期为1年
3. 生物药物库制备试剂盒
以T细胞展示技术为例:T细胞是生产CAR-T药物和构建CAR-T库的关键技术。利用该技术,HTYC将不同的抗体类型(IgG或者VHH),抗体片段(scFv或Fab),或者新型抗体(scIgG或者scFab)的突变文库展示在Jurkat T细胞表面,构建T细胞展示CAR-T库。通过高通量筛选方法,挑选出特异性强、亲和力高、稳定表达、且能够激活T细胞的CAR-T克隆。这样的克隆可以直接用于动物和临床实验。
HTYC T细胞展示系统包括:慢病毒质粒、电转用感受态细胞 stbl3、Jurkat T cells和Su®Fast-Clone Kit。
慢病毒质粒
SU-pWD高效慢病毒整合载体,含有EGFP基因,便于融合蛋白的表达检测;含有卡那霉素抗性基因,有利于表达的临床应用。
SU-pWD与包装质粒pMDLg/pRRE、PMD2.G共转染真核细胞,可有效合成具有感染活性的重组慢病毒。特别适合用于CAR-重组慢病毒的生产。
4. 电转用感受态细胞 stbl3
5.
6.
Jurkat T cells
细胞株购买于ATCC细胞库:https://www.atcc.org/Products/All/TIB-152.aspx
Gib克隆试剂盒(Su®Fast-Clone Kit )
HTYC提供基于GibsonAssembly原理开发的高通量克隆试剂盒,适用于将一个或多个PCR产物或者全合成DNA序列定向克隆到经内切酶处理的线性载体中。
Su®Fast-Clone Kit 优点
1. 定向:载体单酶切和双酶切效果一致,无需担心插入方向
2. 简便:一条或多条插入序列无需酶切便可直接引入载体
3. 高效:仅需50℃作用15~60min即可转化,重组效率可达90%以上
试剂盒组分
Control linearized vector(50ng/μl)、Fast-Clone Mixture(2×)、Control insert(100ng/μl)、ddH2O
本试剂盒应保存于-20℃,保质期为1年。